Bioenergie Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V.

 

Projekte - Details

Verbundvorhaben: Einsatz von genetisch veränderten Hefen für die Entwicklung eines biotechnologischen Verfahrens zur Herstellung von Itaconsäure aus nachwachsenden Rohstoffen, Teilvorhaben 1: Screening, Mutantenselektion, Gentechnik, Stabilitätskontrolle

Anschrift
Technische Universität Dresden - Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften - Fachrichtung Biologie - Institut für Mikrobiologie
01069 Dresden
Helmholtzstr. 10
Kontakt
Prof. Dr. Gerold Barth
Tel: +49 351 463 37617
E-Mail: gerold.barth@tu-dresden.de
FKZ
22004203
Anfang
01.10.2004
Ende
31.12.2007
Aufgabenbeschreibung
Das Gesamtziel besteht in der Entwicklung eines Verfahrens zur biotechnologischen Herstellung von Itaconsäure. Dafür sollen in dem Teilvorhaben Mutantenstämme sowie gezielt genetisch veränderte Stämme isoliert werden, die sich durch eine wesentlich erhöhte Itaconsäuresekretion auszeichnen. Dazu sollen neue Leistungstämme nichtkonventioneller Hefen durch Nutzung molekularbiologischer und genetischer Methoden entwickelt werden. Es ist vorgesehen, dass mittels Mutagenese ein Spektrum von Mutanten er Hefe Yarrowia lipolytica erzeugt wird, unter denen mittels eines spezifischen Screeningsystems Itaconsäure-überproduzierende Mutanten selektiert werden sollen. Zusätzlich soll durch 2 unterschiedliche Vorgehensweisen versucht werden, das Gen für die cis-Aconitsäure Decarboxylase aus dem Genom dieser Hefe zu isolieren und unter der Kontrolle eines starken Promotors in erhöhter Kopiezahl in das Genom wieder zu integrieren, um eine verstärkte Bildung und Sekretion der Itaconsäure zu erreichen. Die isolierten Hefestämme sollen für die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung von Itaconsäure eingesetzt werden. Für itaconsäurebildende Yarrowia Stämme soll das Substratspektrum um nachwachsende Rohstoffe (z.B. Stärkehydrolysate, Glycerol) und deren Abprodukte erweitert werden.
Ergebnisdarstellung
Nach umfangreichem Screening von aus der Literatur als itaconsäureproduzierend aufgeführten Stämmen konnte neben einigen Y. lipolytica-Stämmen die Hefe P. tsukubaensis als aussichtsreichster Itaconsäureproduzent identifiziert werden. Im Screening nach Itaconsäure-bildenden Hefen der Art Y. lipolytica wurden fünf Stämme isoliert, die Itaconsäure ins Medium sekretieren. Der beste Stamm Y. lipolytica H435 wurde einer gentechnischen Bearbeitung unterzogen. Der Stamm Y. lipolytica H435, welcher in der ersten Phase des Stammscreenings als für die Itaconsäureproduktion als geeignet erachtet wurde, konnte in anschließenden Versuchen diese Fähigkeit nicht in dem für die Weiterführung des Projektes notwendigen Umfang bestätigen. Weder in Schüttelkolbenversuchen mit unterschiedlichen Medienbedingungen noch in anschließenden Reaktorversuchen wurden entsprechend hohe Produktkonzentrationen und Produktivitäten erreicht. Die weiteren Arbeiten konzentrierten sich daher auf die Hefe P. tsukubaensis. Parallel zum Substratscreening und der Optimierung der Medienzusammensetzung und Verfahrensparameter wurde P. tsukubaensis (CBS422.96) einer eingehenden gentechnischen Bearbeitung unterzogen. Ergebnis dieser Arbeit war neben der Erkenntnis der Fähigkeit zur Verwertung eines breiten Substratspektrums, insbesondere nachwachsender Rohstoffe, durch diesen Stamm auch die Optimierung einiger Limitations- und Medienbedingungen. Durch Anpassung der Verfahrensparameter, insbesondere die Kultivierung unter oszillierender Gelöstsauerstoff sättigung, konnten die im Schüttelkolbenmaßstab erreichten 14,4 g/I Itaconsäure im Medium auf 66 g/I bei einer Produktivität von 0,34 g/I*h gesteigert werden. Die Produktreinheit betrug dabei 89%. Des weiteren wurde gentechnisch erstmalig nachgewiesen, dass P. tsukubaensis zu transformieren ist und heterologe Gene exprimieren kann. Ein erster Scale-up Versuch im 50 l konnte die generelle Überführung des Bioprozesses aufzeigen.

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Basisdaten Nachwachsende Rohstoffe
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